Pembuatan Sediaan / Preparat Awetan Metode Irisan /Sayatan (Sectioning) dengan Metode Parafin dalam Mikroteknik

Mikroteknik adalah metode / prosedur pembuatan preparat atau spesimen mikroskopis yang akan diamati menggunakan mikroskop.  Dalam mikroteknik, benda yang akan diamati strukturnya disebut preparat atau sediaan.  

Sediaan mikroskopis berupa organisme renik, organ, jaringan, dan sel, baik yang bersifat sementara maupun permanen.  Sediaan/preparat agar dapat diamati dengan jelas dan bagus harus dipersiapkan dengan baik.

Macam-macam metode pembuatan sediaan preparat adalah: 

• sediaan utuh (whole mount), 
• sediaan irisan /sayatan (Sectioning), 
• sediaan uraian, 
• sediaan ulasan / apus (smear), 
• sediaan rentang, 
• sediaan gosok (untuk tulang), 
• sediaan maserasi, 
• sediaan remas (squsah) dan 
• sediaan supravital.

Berikut ini akan dibahas khusus sediaan Sediaana Irisan /sayatan (Sectioning).

Sediaan Irisan /sayatan (Sectioning) yaitu membuat suatu irisan dengan tebal tertentu sehingga dapat diamati melalui mikroskop. Metode ini yang umum digunakan, Tebal-tipisnya sayatan bergantung pada tujuan pengambilan spesimen. Umumnya bersikat antara 6-15 mikron (1 mikron – 0,001 mm). Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang dan lebar yaitu 3 x 2 cm. 

Ada 2 macam metode irisan yaitu : 

• Metode irisan dengan menggunakan tangan dan 
• metode irisan dengan menggunakan mikrotom. 

Pembuatan sediaan dengan menggunakan mikrotom yang mempunyai keuntungan yaitu tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pengguna. 

Metode Irisan /sayatan (Sectioning), (dengan dan tanpa embeding), terdiri dari : 

• Metode parafin, 
• Metode seloidin, 
• Metode resin, 
• Metode beku, dan 
• Metode embeding ganda. 

Pembuatan Preparat Metode parafin 

Metode parafin adalah metode pembuatan preparat dengan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan karena jaringan merupakan bahan yang lunak. Metode paraffin merupakan metode Irisan /sayatan (Sectioning) yang banyak dan umum digunakan, dengan metode ini hampir semua jaringan dapat dipotong dan jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti. Metode parafin merupakan preparat/ sediaan permanen baik pada tumbuhan ataupun pada hewan. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. 

Pembuatan preparat jaringan dengan metode parafin melalui beberapa tahapan, sebagai berikut: 

1. Pembiusan (Narcose) 

Pembiusan (Narcose)  merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar (endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya. Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah: Eter, biasanya digunakan untuk membius kelinci, tikus, marmut, dan anjing. Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera. Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, Morfin HCl, aseton- CHCl3, methane, klereton, alkohol, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium. 

2. Diseksi (Collecting) 

Diseksi (Collecting) adalah proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing). 

3. Pencucian (Washing) 

Pencucian (Washing) jaringan yang diambil pada hewan perlu dilakukan pencucian karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian (Washing) merupakan tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan, pada pembuatan preparat tumbuhan tidak dilakukan pencucian. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai: NaCl 0.8-0.9%, Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi larutan ringer adalah: (NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas), (NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin). NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel. Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut: 1). objek yang diambil dalam kondisi sehat, 2). objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan, 3). menggunakan pisau yang tajam, 4). ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm. 5. langsung dicuci dan difiksasi. 

4. Fiksasi (Fixation) 

Fiksasi (fixation) adalah usaha mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan. Fiksatif yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA (Formaldehyde Acetic Acid). Formula FAA untuk jaringan tumbuhan adalah: Ethil alkohol (50 ml), Asam asetat grasial (5 ml), Formalin (10 ml), Akuades (35 ml). FAA ini juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan adalah: Formalin (10 ml), Alkohol 70% (90 ml), Asam asetat grasial (2 ml). 

Fiksasi (fixation) dilakukan selama 3 jam, tanpa pencucian.

Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada: 1) Jenis jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan intestinum. 2). Tebal atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan yang difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan. 3). Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda. 

Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode parafin adalah: 1). mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme) jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula. 2). mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis. 3). Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan komponen jaringan fiksatif. 

5. Aerasi

Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di vakum, yang bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari membran sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui membran sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi. 

6. Dehidrasi (Dehydration) 

Dehidrasi (dehydration) adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi (dehydration) bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sampel ke dalam larutan dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai konsentrasi air. Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot oil. Alkohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatif lebih murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alkohol dipakai serial dengan konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-50%-70%-80%-95%-100%). Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai stoping point, jaringan dimalamkan. Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alkohol dilakukan setingkat demi setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus dikembalikan ke dehidran. 

7. Penjernihan (Clearing) 

Penjernihan (Clearing) merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alkohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya. Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada: 

1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan. 

2. jenis reagen yang dipakai. 

3. bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk disayat. 

4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene. 

Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih: minyak aniline, Benzene, karbon tetraklorida, karbon bisulfida, minyak kayu cadar, kloroform, minyak cengkeh, Xylol. 

8. Infiltrasi (Infiltration) 

Infiltrasi (Infiltration) adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh 56-58C. 

Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangan langsung dimasukan ke dalam paraffin murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dari prubshsn lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi sangat mengkerut,dll.

Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke paraffin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven. Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup. 

9. Penanaman (Embedding) 

Pada saat memasukan harus diperhatikan bagaimana posisi jaringan/ organ yang akan dipotong, apakan melintang atau membujur, disesuaikan pada saat menanam ke blog. Cara memasukan. Kotak yang sudah jadi, lilin yang sudah cair. Kita masukan penuh, tunggu bberpa menit, hingga mengeras bagian bawah, sehingga organ yang dimasukan pad posisi tengah blok. Bagian atas blog akan mencekung hingga harus diisi lagi lilin yg pinggir di encerkan dengan dipanaskan. Selanjutkan dibiarkan mengering langsung masukan dan air es. Selanjutnya bisa di simpan hingga siap untuk di potong. (disini juga posisi stoping point. Ini blog harus dilekatkan dengan kayu. Tempengn dengan kayu dengan cara dipanaskan. Selnjutnya siap dipotong 

Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen. Paraffin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama dengan paraffin yang digunakan waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat memang sudah bersih dari bahan penjernih.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah: 

Parafin yang digunakan benar-benar bersih dan murni, Peralatan yang digunakan benar-benar khusus untuk prose situ saja, Pembuatan balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar lebih cepat, susun jaringan sesuai dengan orientasi yang direncanakan, Jaringan sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar, Untuk jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup, Jangan sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama dekat jaringan. 

10. Penyayatan (Sectioning) 

Atur posisi pada mikrotom sehingga 20 mikron, standart 8 mikron. Hasilnya berupa fita/band. Siakan wadah yang tepat, atau di atas air hangat/tidak panas. Atau diambil langsung pakai pinset. Letakan di aats gelas objek. Skil) sebelum di potong sudah ada lem. Bahan dasarnya putih telur (hop) hingga sampi kering. Gelas objeknya sudah di rendam dalam alkohol. Di keringkan angin Selanjut di letak dalm hote plate sampai kering. Suhu 40 derjat dan mengembang. Pengirisan menggulung, atau putus.. gagal.. solusi di gosok dengan batu es. Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop. Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel, material embedding dapat disimpan dalam waktu yang lama pada kondisi kering, serta dapat membuat irisan yang tipis. Embedding menggunakan paraffin sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi (Khasim, 2002). Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah: 

· Mikrotom harus seberat mungkin. 

· Meja tempat mikrotom harus stabil 

· Pisau harus cocok dengan mikrotom 

· Posisi pisau harus stabil 

· Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat. 

11. Penempelan dan Afiksasi (Afixing) 

Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek. Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah sebagai berikut 

Putih telur sebanyak 50 bagian
Gliserin sebanyak 50 bagian 

Kristal Tymol beberapa butir
Akuadest beberapa tetes 

12. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining) 

Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari parafin. Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.

Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital

a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa. 

b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna. 

c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan

Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut. 

1. Berdasarkan sifatnya, meliputi: 

a. Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain sebagainya 

b. Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan radikal asam yang tidak berwarna. 

2. Berdasarkan asalnya, meliputi: 

a. Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin campechianum) 

b. Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik. Contoh: basic fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin. 

3. Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi: 

a. Zat warna substantife Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus green B, Neutral red. 

b. Zat warna ajektif 

Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan. 

4. Berdasarkan jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi: 

a. Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna, contohnya untuk melihat polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka digunakan zat warna tunggal gentian violet. 

b. Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin 

c. Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna, contohnya formula Marllory triple staining yang menggunakan zat-zat warna acid fuchsin, aniline blue serta orange G. 

d. Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk tujuan khusus. 

5. Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:  

a. Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safranin 

b. Pewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline blue, asam phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.